本发明公开了一种暗褐网柄牛肝菌菌种衰退的判定方法,通过观察菌落形态、测定生长速率、测定菌落淀粉酶分泌能力、可溶性蛋白分析、酯酶同工酶分析等步骤,对暗褐网柄牛肝菌菌种活性作出预判,找到可以表征暗褐网柄牛肝菌菌种随继代次数增多发生衰退的生理生化特征,为菌种活力鉴定提供了快速有效的判定方法,该方法为暗褐网柄牛肝菌的菌种衰退提供了有效的判定依据,大大降低了误用衰退菌株的风险,有利于暗褐网柄牛肝菌栽培技术的推广。